Er war Hirte und trat mit 15 Jahren in das Noviziat der Kapuziner in Morcone, Italien, ein und wurde mit 19 Jahren Mitglied des Ordens. Er litt unter mehreren gesundheitlichen Problemen, und seine Familie glaubte, er habe Tuberkulose. Im Alter von 22 Jahren wurde er am 10. August 1910 zum Priester geweiht.

Während er vor einem Kreuz betete, empfing er am 20. September 1918 die Stigmata, als erster Priester überhaupt, der so gesegnet wurde. Als sich die Nachricht verbreitete, insbesondere nachdem amerikanische Soldaten nach dem Zweiten Weltkrieg Geschichten über Pater Pio nach Hause brachten, wurde der Priester selbst zu einem Wallfahrtsort für Fromme und Neugierige. Er nahm stundenweise Beichten ab. Im Jahr 1956 gründete er das Haus zur Linderung der Leiden, ein Krankenhaus, das jährlich 60.000 Menschen versorgt. In den 1920er Jahren rief er eine Reihe von Gebetsgruppen ins Leben, die bis heute über 400.000 Mitglieder weltweit haben. Er starb am 23. September 1968 in San Giovanni Rotondo, Foggia, Italien, eines natürlichen Todes.

Sein Heiligsprechungswunder betraf die Heilung von Matteo Pio Colella, 7 Jahre alt, Sohn eines Arztes, der im Haus zur Linderung der Leiden arbeitete. In der Nacht des 20. Juni 2000 wurde Matteo mit einer Meningitis auf die Intensivstation des Krankenhauses eingeliefert. Am Morgen hatten die Ärzte die Hoffnung für ihn verloren, da neun der inneren Organe des Jungen keine Lebenszeichen mehr von sich gegeben hatten. In dieser Nacht, während einer Gebetswache, an der Matteos Mutter und einige Kapuziner aus dem Kloster von Pater Pio teilnahmen, verbesserte sich der Zustand des Kindes plötzlich. Als er aus dem Koma erwachte, sagte Matteo, er habe einen älteren Mann mit weißem Bart und einer langen braunen Kutte gesehen, der zu ihm sagte: "Keine Sorge, du wirst wieder gesund: "Mach dir keine Sorgen, du wirst bald geheilt sein." Das Wunder wurde von der Kongregation und Papst Johannes Paul II. am 20. Dezember 2001 anerkannt.